Laboratoř molekulární, buněčné
a kvantitativní genetiky
Laboratoř se zabývá základním i aplikovaným výzkumem, vysokoškolskou výukou, šlechtitelskou prací a konzultační činností v oblasti udržování genetických zdrojů, reprodukcí a zvyšováním genetického potenciálu u hospodářsky významných druhů ryb. Laboratoř řeší VP 2 Technologie produkce kaviáru v rámci projektu CENAKVA.
Motto: "Na genetice a dědičnosti je mnohem víc, než jen malé pokroucené spirálky."
Terry Pratchett
Molekulární genetika
V oblasti molekulární biologie se zabýváme studiem genetické a populační diverzity hospodářsky významných druhů ryb, raků a jiných korýšů.
V současné době je studium taktéž zaměřeno na praktickou aplikaci molekulárních márkrů v akvakultuře. V oblasti molekulární biologie využíváme:
- Fragmentační analýzu mikrosatelitních márkrů
- PCR-RFLP mitochondriální DNA
- Sekvenování mitochondriálních a nukleárních genů
Kapilárový automatický sekvenátor Applied Biosystems 3500 (vlevo), Sekvenátor nové generace Ion Torrent™ PGM spolu s dalším příslušenství pro emulzní PCR (uprostřed), Průtokový cytometr CyFlow® Cube 8 (vpravo)
Fragmentační analýza mikrosatelitních márkrů
Elektroforegram – výstup fragmentační analýzy mikrosatelitních lokusů z automatického sekvenátoru CEQ 8000 BeckmanCoulter (vlevo); Výsledek analýzy mikrosatelitních lokusů 4 druhů jeseterů a jejich mezidruhových hybridů v programu STRUCTURE (vpravo)
Mikrosatelity jsou tandemové repetice krátkých nukleotidových motivů rozmístěné v jaderném genomu eukaryot. Mikrosatelity představují vysoce polymorfní DNA markery které se vyskytují jak v kódujících, tak v nekódujících oblastech genomu. Fragmentační analýza mikrosatelitních márkrů je používána ke studiu populační a genetické diverzity u hospodářsky vyznamních druhů, jako jsou kapr obecný (Cyprinus carpio), lín obecný (Tinca tinca), korýši (Crustacea,Decapoda), k analýzám rodičovství resp. určení příslušnosti jedinců k populacím. Dále je tato analýza využívána pro stanovení funkční úrovně ploidie jeseterovitých ryb a spolu s využitím moderních statistických metod také k určení původu neobvyklých ploidiních úrovní některých jeseterů.
PCR-RFLP mitochondriální DNA
Elektroforetická separace PCR-RFLP produktů
Pomocí polymorfizmu délky restrikčních fragmentů (RFLP) se identifikují alely na základě přítomnosti nebo absence specifického restrikčního místa. Namnožená genomová DNA (PCR produkt) je štěpena příslušnou restrikční endonukleázou a separována pomocí elektroforézy na agarózovém gelu. Metoda PCR-RFLP je používána ke studiu haplotypové diverzity plemen a línií kapra obecného.
Sekvenace mitochondriálních a nukleárních genů
Chromatogram – grafický výstup z kapilárového automatického sekvenátoru (část; nahoře), haplotypová síť sestrojená pomocí programu Network (vlevo dole); výsledek analýzy molekulární variance (AMOVA; vpravo dole)
Sekvenace genů je především používána ke studiu vzájemného genetického a molekulárně biologického postavení populací ryb a korýšů. Samotná analýza je zaměřena na genetickou charakteristiku jednotlivých druhů jeseterů, plemen a populací kapra lína obecného, jesetera malého resp. populací korýšů rodu Acanthocyclops (Copepoda: Cyclopidae).
Buněčná genetika
V oblasti buněčné genetiky ryb se zabýváme především studiem evoluční polyploidie (např. v čeledi Acipenseridae), spontánní polyploidie nebo polyploidie indukované u hospodářsky významných druhů (Salmonidae, Cyprinidae, Siluridae) sladkovodních ryb a jejími biologickými a chovatelskými dopady. Ke studiu používáme cytometrických technik:
- průtokovou cytometrii
- analýzu obrazu buněk (2-D a 3-D obrazovou cytometrii)
Průtoková cytometrie
je především používána k rutinnímu stanovení úrovně ploidie (haploidie, di-, tri-, tetra-, penta-, hexa-, hepta-, oktaploidie) na základě zjištění relativního množství DNA v jádrech somatických buněk ryb, případně jejich gamet, obarvených DNA-specifickými barvivy. Pracujeme s průtokovým cytometrem Partec CCA-I a dále s nejmodernějším průtokovým cytometrem CyFlow® Cube 8 od fy Partec GmBH (Německo). Další možností je stanovení počtu a koncentrace měřených částic.
Průtokové cytometry Partec CCA-I a CyFlow® Cube 8 od fy Partec GmBH (Německo).
Obrazová cytometrie
Proces počítačové analýzy obrazu erytrocytů lína obecného
Tato technika je kromě základního výzkumu spontánní, evoluční a indukované polyploidie používána v hematologii,histologii a reprodukci ryb a v rámci využití genomových manipulací ve šlechtění ryb.
K našim nejběžnějším aplikacím patří analýza ploidie , na základě rozměrů jader rybích erytrocytů (plocha obvod, dlouhá osa jádra). Srovnávacími metodami jsou analýza karyotypu, kvantifikace ag-NORových míst v interfázních/metafázních buňkách, stanovení relativního obsahu DNA průtokovou cytometrií a stanovení velikosti genomu.
Stanovení absolutního obsahu DNA v buněčných jádrech (velikosti genomu, C-hodnoty) provádíme metodou "Feulgen image analysis densitometry, FIA", čili aplikací analýzy obrazu pro denzitometrická měření buněčných jader v preparátech barevných Feulgenovou reakcí. Kromě mezinárodního standardu (kur domácí, Gallus domesticus; C-hodnota 1,25 pgDNA/jádro; www.genomesize.com) používáme k ověření přesnosti postupu interní standardy diploidního a triploidního lína obecného (Tinca tinca; C-hodnota 1,01 resp. 1,55 pgDNA/jádro). Srovnávací metodou je stanovení absolutního obsahu DNA průtokovou cytometrií v buněčných jádrech obarvených propidiumjodidem.
Počítačová analýza makroskopických objektů (např. jiker, plůdku, ryb, šupin apod.) se rovněž využívá k dalšímu biologickému studiu. Dílčí postupy se uplatňují při ověřování původu, testování užitkovosti šlechtěných ryb a odhadu plemenné hodnoty podle plemenářského zákona.
Pracujeme s analyzátory obrazu Cue-2 Image Analyzer (Galai Production Ltd., Israel) ,Olympus MicroImage verze 3.0.1 a 4.0.1 pro Windows, CellP (Soft Imaging System GmbH) a Image J (NIH, USA).
Konfokálni mikroskopie a 3-D počítačová analýza obrazu
CellP (Soft Imaging System GmbH) a Image J s početnými pluginy jsou používány ke zpracování a měření prostorových obrazů buněk a buněčných struktur získaných konfokální mikroskopií. Systém Olympus LSM Fluoview je připojen k mikroskopu BX 50 a umožňuje dvoukanálovou fluorescenční mikroskopii (488 a 568 nm laser) s použitím různých fluorescenčních barviv k rozlišení buněčných struktur, skenování objektů v ploše (XY) a prostoru (XYZ), včetně skenování v čase a počítačové 3-D rekonstrukce nasnímaných objektů.
Toto vybavení umožňuje pracovníkům a doktorandům ústavu studovat vztahy mezi velikostí genomu, úrovní ploidie a velikostí buňky a buněčného jádra v 3-D prostoru zejména u ryb s vyšší úrovní ploidie (hexaploidie až dodekaploidie), morfologii krevních buněk různých druhů ryb z intaktních populací a z testů toxicity různých vodních polutantů, morfologii a fyziologii rybích gamet a detailní průběh oplozovacího procesu.
Konfokální laserový mikroskop Olympus LSM Fluoview (vlevo), 3-D rekonstrukce jader erytrocytů polyploidních ryb (Bytyutskyy a kol., 2014) (vpravo)
Kvantitativní genetika
V oblasti kvantitativní genetiky je náplní laboratoře studium užitkových vlastností ryb. V současné době je studium zaměřeno na růstové vlastnosti (délka těla, hmotnost) a výtěžnostní charakteristiky (podíly filetů a opracovaného trupu) u kapra obecného s cílem odhadnout v první fázi heritabilitu (dědivost) těchto vlastností a ve druhé fázi zjistit skutečnou odezvu na selekci u vlastností s uspokojivou heritabilitou. Systematická selekce na zvyšování genetického potenciálu růstových vlastností nebyla u kapra obecného doposud uplatňována, zato je hojně využívána u ostatních druhů ryb.
Oblast kvantitativní genetiky musí být z důvodu specifik v chovu ryb v rybnících napojena na metody molekulární biologie a genetiky, které umožňují určování původu potomstva – přiřazování potomků k jejich příslušným rodičovským párům ve smíšených obsádkách. Do budoucna je počítáno z rozšířením výzkumu i na lína obecného, popř. další druhy ryb a rovněž na studie MAS (marker assist selection) nebo vyhledávání QTL (Quantitative trait loci) u kapra obecného.
Oblast kvantitativní genetiky je také velice úzce napojena na rybí líheň (Genetické rybářské centrum fakulty) se šlechtitelskou stanicí, nebo se spolupodílí na programu testování užitkovosti ryb na fakultě i na ostatních rybářských podnicích a statisticky zpracovává posbíraná data.
