Laboratoř zárodečných buněk
Laboratoř se od svého vzniku v roce 2015 zabývá biologií zárodečných buněk (prekurzorů gamet) u několika druhů ryb, kdy se jedná o čistě modelové druhy (dánio pruhované, karas zlatý), druhy akvakulturní (kapr obecný), ale i kriticky ohrožené zástupce jeseterovitých. Zá účelem studia zárodečných buněk jsou využívány multidisciplinární přístupy, které zahrnují molekulární analýzy (genová exprese, mikrosatelity), chromosomové manipulace (indukce uniparentální dědičnosti a polyploidie), histologie, immunoznačení, průtoková cytometrie, editace genomu pomocí CRISPR/Cas9 systému a transplantace zárodečných kmenových buněk ryb s cílem indukce chimérismu a produkce potomstva prostřednictvím náhradních rodičů.
Obr. 1. Transplantace zárodečných buněk kapra obecného do tělní dutiny karase zlatého. A) Suspenze buněk je pro lepší viditelnost obarvena metylenovou modří. B) Snímek transplantované larvy karasa zlatého ze světlého pole. B´) Snímek pořízení na fluorescenčním kanálu DsRed, kde je možné lokalizovat pozici transplantovaných buněk, u kterých byly obarveny buněčné membrány.
Výzkumníci laboratoře zárodečných buněk dosáhli několika úspěchů s výzkumem jeseterovitých ryb, kdy lze zmínit úspěšné provedení jaderného transferu, objasnění fenoménu polyspermie, popsání specifikace a migrace primordiálních gonocytů, ale i zmrazení a následnou transplantaci zárodečných kmenových buněk. Jedním z dlouhodobých cílů laboratoře je transplantace zárodečných buněk mezi dlouho dospívajícími druhy jeseterů, do jesetera malého, kdy je předpokládáno značné zkrácení reprodukčního cyklu, který je obvykle v desítkách let. Pro tento účel bylo vyvinuto několik technik netransgenní a transgenní sterilizace jesetera malého.
Obr. 2. Snímky z elektronového mikroskopu, které zachycují několik mikropylárních otvorů (otvor pro průchod spermie) u vajíčka jesetera, kdy je na detailu mikropyle (B) zřetelná přítomnost několika spermií, které následně vedou ke vzniku polyspermních jedinců snadno identifikovatelných dle atypického dělení zachyceného na obrázku 2.
Obr. 3. Atypické ryhování u polyspermních embryí jiker jesetera (A, B), kdy vzniká embryo se třemi blastomerami, které se dále dělí. Oproti tomu se kontrolní embryo rýhuje vždy vzorcem 2-4-8-16 atd buněk.
Současný výzkum jeseterů v laboratoři se zabývá především molekulární charakterizací zárodečných buněk u juvenilních jedinců, který může přinést nové poznatky ohledně determinace a vývoje pohlaví. Pro tyto účely je využíváno sortování buněk a in vitro kultivace buněk s následným sekvenováním RNA. Dále je studován vývoj endodermu a osud žloutkových buněk u archaických druhů ryb, který vykazuje poměrné unikátní mechanismy.
Obr. 4. Morfologie zárodečných buněk jesetera v buněčné kultuře.
Obr. 5. Embryo jesetera se zastaveným rýhováním v oblasti označené červeným obdélníkem. Vlevo snímek ze světlého pole, vpravo snímek na fluorescenčním kanálu GFP.
Obr. 6. Snímek spermií křížence kapra obecného a karase stříbřitého pořízený skenovacím elektronovým mikroskopem. Vlevo je normální spermie s jedním bičíkem, spermie napravo jsou abnormální mající dva bičíky.
Laboratoř disponuje dvěma recirkulačními systémy pro chov dánií pruhovaných, ve kterých se nachází několik transgenních linií, které jsou využívány pro studium zárodečných buněk prostřednictvím různých způsobů transplantace, ale i studium metabolismu lipidů s využitím editace genomu. Chovná kolonie dánií také slouží jako prvotní model pro předběžné studie, které jsou následně prováděny u jeseterů. Zároveň členové laboratoře poskytují podporu kolegům z ostatních laboratoří, kteří provádějí experimenty na tomto modelovém druhu. Laboratoř dále využívá kapacit akvarijní místnosti, kde jsou odchovávány chiméry karasa zlatého, které po transplantaci produkují gamety kapra obecného. Ve výzkumu nejsou opomíjeny i méně tradiční a známé druhy ryb jako je například sekavec, který nabízí unikátní možnosti pro studium pohlavního a nepohlavního rozmnožování.
Obr. 7. Umělý výtěr dánia pruhovaného. A) Odběr spermií ze samce. B) Odběr jiker ze samice.
Obr. 8. Mikroinjikace embryií dánia pruhováne fluorescenčním barvivem (A), které je detekovatelné pod specifickým osvětlením (B,C).
Obr. 9. Dospělí jedinci sekavce písečného z laboratorního chovu.
Laboratoř je vybavena kvalitní technikou pro vizualizaci (motorizovaný fluorescenční mikroskop a stereomikroskop), několika stereomikroskopy využívajících světlého pole pro rutinní mikromanipulace s mikroinjektory (pneumatické i manuální) a mikromanipulátory (robotizovaný i manuální) s možností připojení zařízení s piezo pohonem pro zefektivnění mikroinjikace. Dále je laboratoř vybavena průtokovým cytometrem pro analýzu ploidie, vysokapacitní centrifugou s chlazením, vybavením pro práci s nukleonovými kyselinami (laminární box, spektrofotometr, thermocycler, kapilárová a gelová elektroforéza) a elektroporátorem.
Obr. 10. Robotizovaný fluorescenční stereomikroskop s mikromanipulátorem a mikroinjikátorem pro práci s embryi ryb.
Obr. 11. Laboratoř s vybavením molekulární a buněčnou analýzu.
Obr. 12. Recirkulační systémy pro chov dánií pruhovaných.
Členové laboratoře úzce spolupracují s tuzemskými ale i zahraničními institucemi. Příkladem lze zmínit Laboratoř genetiky ryb Ústavu živočišné fyziologie a genetiky AV ČR, Laboratoř genové exprese Biotechnologického ústavu AV ČR, Laboratoř kraniofaciální evoluce a vývoje Karlovy Univerzity. Ze zahraničních institucí se jedná především o Laboratoř fyziologie a genomiky ryb, Rennes ve Francii, Univerzitu v Ehime a Hokkaido v Japonsku.
